植物組織培養滅菌及無菌操作技術
2009-12-08
植物組織培養滅菌及無菌操作技術
［目的要求］
認識各類滅菌劑，掌握其性質、使用方法；通過在超凈工作臺上進行無菌操作訓練，使學生初步掌握組織培養的無菌操作技術，養成無菌操作習慣。
［知識模塊］
滅菌技術、無菌操作技術
［重點］
植物組織培養各類設備及人員消毒的方法
［難點］
無菌操作規程
［方法］
采用一體化教學方法，教師借用多媒體進行簡要的講授后學生分組操作實踐。
一、植物組織培養滅菌
1．濕熱滅菌（培養基）：在制備后的24h內完成滅菌工序。
⑴對高壓滅菌后不變質的物品，可以延長滅菌時間或提高壓力。
⑵對于一些布制品，洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。
⑶高壓滅菌前后的培養基，其pH值下降0.2-0.3單位，要控制好滅菌的溫度和時間。
⑷高壓滅菌通常會使培養基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養基的滲透壓。
⑸培養基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。
注意事項：防止高壓滅菌培養基變化的方法
(1)經常注意搜集有關高壓滅菌影響培養基成分的資料，及時采取有效措施。
(2)設計培養基配方時盡量采用效果類似的穩定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對高壓滅菌下培養基中成分的影響等。
(3)配制培養基時應注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。
(4)注意高壓滅菌后培養基pH值的變化及回復動態。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。這樣在實驗中就可以根據這一規律加以掌握。
2.過濾滅菌（不耐熱的物質 ）如一些抗生素類物
3.紫外線和熏蒸滅菌（空間）
(1)紫外線滅菌：在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線的波長為200—300nm，其中以260nm的殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。在接種前打開紫外燈進行房間及超凈臺滅菌30min，然后進行接種。
(2)熏蒸滅菌：用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變為氣體狀態擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可。
常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關閉緊密，按5—8ml／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發。熏蒸時，房間可預先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。
4.噴霧滅菌（物體表面）
物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%—1%的新潔爾滅也可以。
5.植物材料表面用消毒劑滅菌（外植體）
從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養基，便會造成培養基污染。因此，植物材料必須經嚴格的表面滅菌處理，再經無菌操作手續接到培養基上，這一過程叫做接種。
第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。
洗時可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質性的物質，便于滅菌液的直接接觸。當然，最理想的清洗物質是表面活性物質—吐溫。
第二步對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。
第三步用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1—2種使用見表。
常用滅菌劑使用濃度及效果比較表
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滅菌劑
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使用濃度(%)
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持續時間（min）
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去除的難易
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效果
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次氯酸鈣
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9～10
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5～30
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易
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很好
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次氯酸鈉
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2
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5～30
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易
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很好
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氯化汞
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0.1～1
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5～8
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較難
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最好
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抗菌素
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4～50mg/L
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30～60
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中
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較好
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上述滅菌劑應在使用前臨時配制，滅菌后用無菌水涮洗3—4次即可；用升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒較難去除，所以應當用無菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。
滅菌時，把瀝干的植物材料轉放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒人消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅除氣泡，使消毒徹底。滅菌時間是從倒人消毒液開始，至倒入無菌水時為止。吐溫的用量和滅菌時間，一般加入滅菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。
最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。
二、無菌操作技術
一、用品
超凈工作臺、75％的酒精、95％的酒精、盛有培養基的培養瓶、接種器械（主要指解剖刀、剪刀、鑷子等）、酒精燈、培養材料（根、莖、葉或種子等）、0．1％的升汞（或漂白粉）、無菌水等。
二、方法步驟
（一）在接種前4h用甲醛與高錳酸鉀混合薰蒸接種室，并打開紫外燈照射30min；
（二）正式接種前半小時左右，打開超凈工作臺上的紫外燈和風機，20～30min后接種；
（三）用肥皂水洗凈雙手，在緩沖間內穿好滅過菌的實驗服、帽子與拖鞋，進入接種室；
（四）用75％的酒精擦拭工作臺面和雙手；
（五）用蘸有75％酒精的紗布擦拭裝有培養基的培養器皿，放進工作臺；
（六）把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95％酒精中，在火焰上滅菌后，放在器械架上；
（七）把植物材料放進75％的酒精中浸泡約30s，再在0．1％的升汞中浸泡5～10min，或在10％的漂白粉上溶液中浸泡10～15min，浸泡時可進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸；然后用無菌水沖洗3～5次；
（八）用火焰燒瓶口，轉動瓶口使瓶口各部分都燒到，打開封口塑料；
（九）取下接種器械，在火焰上滅菌；
（十）把培養材料迅速放入培養瓶，扎上瓶口（每人接種5～10瓶）。操作期間應經常用75％酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應反復在95％的酒精中浸泡和在火焰上滅菌；
（十一）接種結束后，清理和關閉超凈工作臺。