培養基及設備的滅菌
一、定義
1，培養基滅菌的定義
是指從培養基中殺滅有生活能力的細菌營養體及其孢子，或從中將其除去。工業規模的液體培養基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。
2，滅菌與消毒的區別
滅菌：用物理或化學方法殺死或除去環境中所有微生物，包括營養細胞、細菌芽孢和孢子
消毒：用物理或化學方法殺死物料、容器、器皿內外的病源微生物。
二、培養基滅菌的目的
1，在發酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果：
生產菌和雜菌同時生長，生產菌喪失生產能力；
在連續發酵過程中，雜菌的生長速度有時會比生產菌生長得更快，結果使發酵罐中以雜菌為主；
雜菌及其產生的物質，使提取精制發生困難
雜菌會降解目的產物；
雜菌會污染最終產品，雜菌會污染最終產品；
發酵時如污染噬菌體，可使生產菌發生溶菌現象。
2，工業上具體措施包括：
（1）使用的培養基和設備須經滅菌；
（2）好氧培養中使用的空氣應經除菌處理；
（3）設備應嚴密，發酵罐維持正壓環境；
（4）培養過程中加入的物料應經過滅菌；
（5）使用無污染的純粹種子。
3，培養基滅菌的目的
殺滅培養基中的微生物，為后續發酵過程創造無菌的條件。
4，培養基滅菌的要求
（1）達到要求的無菌程度（10-3）
（2）盡量減少營養成分的破壞，在滅菌過程中，培養基組分的破壞，是由兩個基本類型的反應引起的：
? 培養基中不同營養成分間的相互作用；
? 對熱不穩定的組分如氨基酸和維生素等的分解。
5，滅菌的方法
（1）化學法
化學藥品滅菌法
（2）物理法
干熱滅菌法
濕熱滅菌法
射線滅菌法
6，濕熱滅菌的原理
每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍。當微生物處于最低溫度以下時，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態。當溫度超過最高限度時，微生物細胞中的原生質膠體和酶起了不可逆的凝固變性，使微生物在很短時間內死亡，加熱滅菌即是根據微生物這一特性而進行的。
7，濕熱滅菌中的相關定義
• 殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時間稱為致死時間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。
• 微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。相對熱阻是指某一微生物在某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。
各種微生物對濕熱的相對熱阻
微生物 相對熱阻
營養細胞和酵母
細菌芽孢
霉菌孢子
病毒和噬菌體 1.0
3×106
2~10
1~5
8，濕熱滅菌的優點
• 蒸汽來源容易，操作費用低，本身無毒；
• 蒸汽有強的穿透力，滅菌易于徹底；
• 蒸汽有很大的潛熱；
• 操作方便，易管理。
第二節 濕熱滅菌的理論基礎
一，培養基濕熱滅菌需解決的工程問題
1，將培養基中的雜菌總數N0 殺滅到可以接受的總數N（10-3）， 需要多高的溫度、多長的時間為合理。
2， 菌溫度和時間的確定取決于：
（1）雜菌孢子的熱滅死動力學
（2）反應器的形式和操作方式
（3）培養基中有效成分受熱破壞的可接受范圍
二、微生物的熱死滅動力學方程
實驗證明，微生物營養細胞的均相熱死滅動力學符合化學反應的一級反應動力學，即：
N：任一時刻的活細菌濃度（個/L）
t：時間（min）
K：比熱死速率常數（min-1）取邊界條件t0=0，N=N0，對（1）積分得
或
實驗還證明，細菌孢子的熱殺滅動力學與營養細胞的有所不同。它表現為非對數的死亡動力學。這可能與孢子壁的化學成分及結構有關。但當溫度超過120?C時，熱阻極強的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的熱殺滅動力學也接近對數死亡動力學即符合一級反應規律。
三、溫度對K的影響
微生物的熱死滅動力學接近一級反應動力學，它的比熱死滅速率常數K與滅菌溫度T的關系可用阿累尼烏斯方程表征
A：頻率因子（min-1）
ΔE：活化能（J/mol）
R：通用氣體常數[J/（mol.k）]
從方程（4）可以看出：
（1）活化能ΔE的大小對K值有重大影響。其它條件相同時，ΔE越高，K越低，熱死速率越慢。
（2）不同菌的孢子的熱死滅反應ΔE可能各不相同。
對方程（4）兩邊取對數，得方程（5）
K是ΔE和T的函數，K的對T的變化率與有關，對方程（5）兩邊對T取導數，得方程（6）。由方程（6）可得出結論：反應的ΔE越高，lnK對T的變化率越大，即T的變化對K的影響越大試驗表明，細菌孢子熱死滅反應的ΔE很高，而某些有效成分熱破壞反應的ΔE較低（見下表）。將溫度提高到一定程度，會加速細菌孢子的死滅速度，縮短滅菌時間，由于有效成分的ΔE很低，溫度的提高只能稍微增大其破壞速度，但由于滅菌時間的顯著縮短，有效成分的破壞反而減少。
受熱物質 ΔE（J/mol）
維生素B12
維生素B1鹽酸鹽
嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子
肉毒梭菌孢子
枯草桿菌孢子 96232
92048
283257
343088
317984
如嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的ΔEBS =67000× 4.184（J/mol），維生素B1的ΔEVB=22000× 4.184 （J/mol），將滅菌溫度從105?C提高到127?C，KVB從0.02（min-1）提高到0.06（min-1），KBS從0.12（min-1）提高到40.0（min-1）。
嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子和維生素B1的lnK-1/T圖
嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子死滅程度為N/N0=10-16時，滅菌溫度對維生素B1破壞的影響滅菌溫度（?C） 達到滅菌程度的時間（min） 維生素B1的損失（%）
100
110
120
130
140
150 843
75
7.6
0.851
0.107
0.015 99.99
89
27
10
3
1
第三節 培養基滅菌的工程設計一、無菌的標準
根據微生物熱死滅方程，要求滅菌后達到絕對無菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設計中常取N=10-3。
二、分批滅菌
1，分批滅菌的設計在發酵罐中進行實罐滅菌，是典型的分批滅菌。全過程包括升溫、保溫、降溫三個過程。
孢子熱死亡的規律符合積分得（8）
在分批滅菌過程中
因為升溫、冷卻階段T是時間t的函數，K不是常數，所以：
式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數
分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時間變化關系
T：介質溫度（K）；T0：介質初溫（K）；t：時間（min）；h：蒸汽相對于介質的熱焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min）；M：介質重量(kg)；Cp：介質比熱[kJ/(kg.K)]； TH：熱源溫度(K)；U：總傳熱系數[kJ/（m2.min.K）]；q：傳熱速率（kJ/min）；C’p：冷卻劑比熱；W：冷卻劑流率；TCO：冷卻劑溫度2，計算舉例（自學）
參見：《微生物工程工藝原理》P226、倫世儀主編《生化工程》P13。3，保證間歇滅菌成功的要素
（1）內部結構合理(主要是無死角)，焊縫及軸封裝置可靠，蛇管無穿孔現象
（2）壓力穩定的蒸汽
（3）合理的操作方法。
發酵罐的接管圖4，培養基間歇滅菌過程中應注意的問題（1）溫度和壓力的關系
（2）泡沫問題
（3）投料過程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問題
（4）滅菌結束后應立即引入無菌空氣保壓
三、連續滅菌的設計1，連續滅菌的流程（1）噴射加熱連續滅菌
噴射加熱連續滅菌流程
典型的噴射加熱連續滅菌時的溫度和時間曲線圖
（2）薄板換熱器連續滅菌
薄板換熱器連續滅菌流程
薄板換熱器連續滅菌時的溫度和時間曲線圖
（3）噴淋冷卻連續滅菌
噴淋冷卻連續滅菌流程
2，連續滅菌設計及計算舉例（自學）
參見：《微生物工程工藝原理》P228，倫世儀主編《生化工程》P22。3，連續滅菌設備的結構及計算
（1）設備結構：
套管式連消塔
噴嘴式連消塔
連消器
噴射加熱器
薄板換熱器
維持罐
（2）連消塔計算（自學）
參見《發酵工程與設備》P53
四、連續滅菌與間歇滅菌的比較1，連續滅菌的優缺點
優點
–保留較多的營養質量
–容易放大
–較易自動控制；
–糖受蒸汽的影響較少；
–縮短滅菌周期；
–在某些情況下，可使發酵罐的腐蝕減少；
–發酵罐利用率高；
–蒸汽負荷均勻。
缺點
–設備比較復雜，投資較大。2，分批滅菌的優缺點
優點
–設備投資較少
–染菌的危險性較小
–人工操作較方便
–對培養基中固體物質含量較多時更為適宜
缺點–滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大，一般只限于中小型發酵裝置。
五、影響滅菌的因素（1）培養基成分對滅菌的影響
油脂，糖類及一定濃度的蛋白質可增加微生物的耐熱性，另一些物質，如高濃度的鹽類，色素等可削弱其耐熱性。
（2）培養基的物理狀態對滅菌的影響
（3）培養基中微生物數量對滅菌的影響
（4）培養基中氫離子濃度對滅菌的影響
培養基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養基的 酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。（5）微生物細胞中水分對滅菌的影響
細胞含水越多，蛋白質變性的溫度越底
（6）微生物細胞菌齡對滅菌的影響
老細胞水分含量低、低齡細胞水分含量高
（7）空氣排除情況對滅菌的影響
（8）攪拌對滅菌的影響
（9）泡沫對滅菌的影響
六、發酵罐的滅菌培養基的滅菌如果是采用連續滅菌法。則發酵罐應在加入滅菌的培養基前先行單獨滅菌。通常是用蒸汽加熱發酵罐的夾套或設管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個容器后，再從徘氣管中緩緩排出。容器內的蒸汽壓力保持1公斤，20分鐘。在保溫結束后，關鍵是隨即通入無菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。
七、補料液的滅菌在發酵過程中，往往要向發酵罐中補入各種不同的料液。這些料液都必需經過滅菌。滅菌的方法則視料液的性質、體積和補料速率而定。如果補料量較大，而具有連續性時，則采用連續滅菌較為合適。也有利用過濾法對另補料液進行除菌。補料液的分批滅菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附屬設備和管道都要經過滅菌。
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